核酸分子分选技术助力单病毒基因组学研究

向测序通过将资源集中在感兴趣的分子上，以实现高灵敏度及经济有效的目标区域深度平行测序。通常感兴趣的靶标或生物以百分之几的比例存在，处于治疗中的病毒 DNA 更是以人基因组的十亿分之几存在。为避免 DNA 测序的大量浪费，需要对靶标进行富集，然而现有的 PCR 或杂交捕获方法在靶向富集能力和目标捕获长度方面都很有限。

据此，来自加州大学旧金山分校的科学家们开发了基于微流控单液滴分选技术对靶标核酸富集，实现了使用最小的先验目标信息，实现长度为 >10 kbp 分子的百万倍富集。本研究通过对 HIV 感染者的 HIV 原病毒单个基因组的分离和测序证明这种方法的有效性。该方法适用于研究和临床应用中的罕见靶点测序，包括识别癌症相关突变或感染细胞的病毒测序，研究结果发表在《Analytical Chemistry》杂志上。

1、需要富集的 DNA 混合物、引物、探针及反应 mix 混合；

2、用数字 PCR 液滴包裹仪将上述反应体系分割成单液滴；

3、PCR 扩增；

4、微流控单液滴分选富集阳性液滴并回收 DNA；

5、DNA 与引物、探针及反应 mix 混合并 PCR 扩增；

6、二次液滴分选；

7、回收 DNA 测序或 qPCR 检测。

1、数字 PCR 扩增后进行单液滴阳性分选，成功从含 10⁷倍 lambda DNA 背景中富集出了 ΦX 174 病毒基因组 ，第一轮富集度为 160 倍，第二轮富集达 16000 倍，证实单液滴分选联与数字 PCR 用可实现对微量靶标基因组的高效富集。

2、将感染 HIV 病毒的细胞与非 HIV 感染细胞 gDNA 混合以模拟潜伏感染 HIV 的浓度，之后通过数字 PCR 与单液滴分选联用富集回收含 HIV 的液滴，测序结果显示：

● 分离出了含完整病毒基因组的液滴，富集度高达 600 万倍；

● 不但实现了单个病毒的分离和测序，还获得整合的原病毒全长基因组；

● 确定 HIV 在宿主基因 ARIH2 中的整合位点；

● 有效的解决了抗逆转录病毒治疗期间低载量 HIV 的检测，为单病毒基因组学研究提供强大工具。

数字 PCR 技术与单液滴分选技术联合用于富集微量核酸靶标测序：

1、能以最小的已知序列富集长片段分子，如对 ≥100 kb 的分子进行百万倍富集，可用于宏基因组样本中人类基因突变或自然产物基因簇富集测序特征分析。

2、该方法可检测到任何核酸，包括通过添加逆转录步骤的 RNA，可以实现对融合基因或低丰度变异进行测序。

3、能对如 HIV 等罕见单一病毒基因组高灵敏度回收和测序，为单个病毒基因组学的研究提供强大工具。

达普生物秉承为广大科研及临床工作者和企业客户提供世界领先技术平台的理念，聚团队研发力量结晶开发了基于微流控技术的单液滴分选和数字 PCR 技术平台—— Comet 彗星单液滴分选仪 + Nebula 星云全自动数字 PCR 系统，全面解决超微量核酸靶标测序瓶颈，为单个病毒基因组学、靶序列富集相关的宏基因组测序，低丰度变异样本、融合基因等研究提供强大工具。