液滴微流控技术与酶定向进化：高通量筛选策略驱动的革新

进化对于生命的产生和复杂性的生成是至关重要的，会引起生物各个层次的多样性：从生物圈层、物种、生物个体甚至到分子层面。在分子生物学层面，酶是自然界中特有的催化剂，将反应壁垒降低，从而特异性地使某些反应加速。在自然界中，酶经历了自然选择进化，从而使生物体内的反应特异与高效。但由于酶的自然活性通常不足以满足工业化应用的需要，因此人工选择和筛选变得越来越重要。整个产业也从天然酶的简单发现过渡到对于酶特定功能的定向优化。

过去，酶定向进化及筛选天然新酶的通量极大程度受限于筛选工具与方法学。经过二十年的发展，科学家们开发了基于液滴微流控的通用工具以满足超高通量筛选的需求。从批量乳化到芯片上的液滴制备和分选，微流控技术提供了众多用于高通量筛选的工具，定向进化大大受益于这些技术进步。下面，我们将按时间顺序为大家梳理酶定向进化与基于微液滴微流控筛选的交织发展历史。

1．开拓时代的诺奖获得者：琼脂板筛选与中低通量 MTP 测定

2018 年诺贝尔化学奖授予了美国科学家 Frances Arnold 和 George Smith 以及英国科学家格 Gregory Winter，以表彰他们在酶的定向演化以及用于多肽和抗体的噬菌体展示技术方面取得的成果。定向进化使得通过基因手段改善生物活性成为可能，这种方法通常比自然选择更快且更易控制。定向进化研究除了对科学进步具有重要意义以外，同时具有巨大的工业潜力应用价值。它能以简单快捷的方式替代漫长而昂贵的自然进化过程。这种方法因此提供了一种环境友好的途径，将酶作为替代传统化学的方法加以利用。

在一项开创性的研究中，Arnold 及其同事通过微量滴定板（MTP）筛选突显了使用 Subtilisin E 进行定向进化的潜力。通过筛选约 4000 个菌落，他们进化出了一种能够在 60％ 二甲基甲酰胺（DMF）中对肽底物的水解效率比野生型提高 256 倍的突变体。之后，许多聚焦微量滴定板（MTP）的体外和体内研究被陆续报道。

另一种中通量的方法是使用琼脂板筛选分析。其中一个典型的例子就是将转氨酶作为手性胺合成的生物催化剂进行定向进化。这是将酶催化反应封闭在细胞内或将荧光产物固定在细胞表面以提高通量的另一种策略，已被应用于多个系统，例如 P450 单加氧酶的进化。

上述方法开创了酶筛选进化的时代，而时代的快速发展，也让这些方法迅速遇上了瓶颈。如果对蛋白质的结构-活性位点不太清楚，需要筛选大量突变体才能获得目标表型：通常通过对蛋白质进行更全面的突变实现，因此需要筛选的突变体数量呈指数增长。例如，以对 4 个位置同时随机化为例，需要筛选 300 万以上的突变体。使用基于微量滴定板的常规筛选方法可能需要超过 80 年（大约 20 个博士！）的手动筛选，并需要大耗材，如筛选缓冲液（> 100 L）和昂贵的催化剂溶液（> 1 L）。相比之下，同样的筛选工作使用液滴微流控或者荧光激活细胞分选（FACS）筛选方法，单个操作员大约一周内即可完成，且所需耗材大大降低（图 1）。

图 1.

2．向高通量迈进：光学读数与 FACS 的兴起

光学读数的兴起与 FACS 技术的应用，在酶定向进化迈向高通量的路上起到了关键性作用。在定向进化中，将目标酶的活性（即表型）与其遗传信息（即基因型）联系起来是一个关键点，这对于筛选、选择和最终的进化活动是至关重要的。为了实现大规模筛选，快速的表征方法如光学读数方法（颜色、荧光或发光），是必不可少的。通常，工业上相关的目标产物缺乏容易检测的表型。在这种情况下，需要使用产生荧光、发光或比色读数的底物类似物，这些读数与酶活性相关联。通过这些底物，我们就可以使用光学表征方法快速地对酶的活性进行判读。例如将酶反应在细胞内/外隔离或将荧光产物固定在细胞表面上使用 FACS 能够快速并高通量地筛选。这些策略为FACS等高通量分析方法开辟了道路 。

虽然荧光产物留在细胞内或固定在细胞上的方法与高通量 FACS 兼容，但存在潜在的交叉污染风险，产生假阳性。并且FACS筛选方法与某些底物不相容，导致 FACS 在酶进化方向的应用受限，需要寻求新的方法解决这些问题。

3．超高通量新时代：微滴微流控技术的发展

工程学和生物化学研究者一起努力 20 多年，通过不断改进现有系统并开发出新的微滴微流控系统（图 2），在酶定向进化中实现了一些里程碑的应用。液滴微流控技术制备的表面活性剂稳定的单（油中水）或双（油中水中）乳化液滴（分别为 SEs 和 DEs），因其对温度、pH 等一系列物理化学因素的长期稳定性，构成了定向进化的最佳体外间隔（IVC），能够避免潜在的交叉污染， 并能兼容不同的底物，保持表型-基因型连锁。微滴微流控技术的迅猛发展，让大家意识到该技术能够解决 FACS 的瓶颈问题，因此，酶进化领域也迅速地对微滴微流控技术的应用展开了深入且广泛的研究。

IVC 在过去 20 年中受到广泛关注，并与定向进化研究的发展同步进行。定向进化研究直接受益于液滴微流体的发展，让科学家们能够更快速地筛选更大的文库。反过来，对更细分和强大的定向进化对工具的需求也推动了微滴微流控技术的研究进展。

图 2. 过去二十年，液滴微流控技术发展与酶定向进化应用的里程碑

油包水液滴，也称为单乳液液滴，是被油相包围的水室。通过使用表面活性剂（即在水/油界面上，两性分子自动排列的分子）可以稳定这些液滴。随着研究的不断深入和发展，科学家们也开发了增加复杂性的液滴生成方法，以更好地控制液滴的大小、吞吐量或试剂的封装。

1．技术进展 I：基于微流控的液滴形成

液滴微流控技术的发展，可以更好的控制高通量的单分散液滴的生成和包裹。与大体系不均匀乳化的方法相比，微流控方法需要制造设备并操作，但能够高通量封装分散液滴（图 3A）。Thorsen 等人的第一项研究介绍了用一个T形交叉口装置以 20-80 Hz 频率能产生乳液的方法（图 3B）。Anna 等人展示了在流动聚焦通道几何形状下控制了小至 10 μm 直径的液滴形成（图 3C）。后来使用了类似的通道几何形状来实现不同的功能：液滴内试剂混合、液滴分裂，不同大小液滴的自发合并和试剂注入液滴。

图 3. 基于微流控芯片的单分散水/油（w/o）乳液微滴形成

对于定向进化而言，每个液滴理想情况下应当只包含一个细胞。然而，使用微流控装置进行细胞包裹遵循泊松分布，低细胞浓度时会导致大多数液滴为空液滴，从而降低有效通量。一些研究表明可以在微流控装置上克服泊松分布的限制。使用特定的通道几何形状和在高流速下产生的流体动力学效应来排序细胞，不同的细胞类型包裹率都高达 80% （图 3D）。

另一个影响液滴微流控系统与定向进化兼容性的关键方面在于液滴能将目标酶反应底物和产物限制在微液滴反应体系中。Courtois 等人在他们的研究中探究了荧光素衍生物底物从液滴渗漏到油相中的情况，并通过添加牛血清白蛋白将保留时间提高到了 18 个小时以上。作者通过表征大肠杆菌细胞表达的碱性磷酸酶的酶活性及区分了空滴与含有细胞的滴液，证明了系统的多功能性。另外，使用前面描述的凝胶珠也可以解决 w/o 乳液中底物和产物的保留问题，这种凝胶珠同样可以通过液滴微流控技术制备（图 3E）。

2．技术进展 II：芯片上液滴的观察、操纵和分选

到目前为止，所描述的大多数技术发展都是基于对一步法的过程和反应进行的优化。然而，许多反应需要多个步骤，需要添加新的试剂或不同的反应条件。随着液滴微流控技术的发展，液滴生成、融合、控制和分析等更多选择陆续出现（图 4）。

图 4. 技术进展 II：在芯片上观察、操纵和分选液滴

微流控技术的一个重要进展是在微流控通道中集成产生电场的电极。Chabert 等人在早期研究中探讨了使用液滴微流控添加试剂的方法。利用交流电场，他们在静态和流动条件下成功地移动和合并了直径为 600 微米的液滴。先驱性的研究又推动了高通量控制试剂注入液滴的开发。

然而，电极的使用不局限于液滴融合，而且还能用于液滴的移动。Ahn、Kerbage 等人就报道了一种基于介电泳力将液滴引导至微流控通道交联处的任意一侧，从而实现对于微液滴的分选。在对微液滴能够实现操作后，一些研究小组也开发了在芯片上对液滴中进行荧光检测技术。在早期的研究中，Dittrich 等人将体外表达反应体系和红移荧光蛋白的基因片段（rsGFP）包裹在液滴中注入微流控芯片，并使用荧光光谱在芯片上检测微液滴中蛋白的荧光信号。结合灵敏的荧光检测和介电泳分选技术，第一款荧光液滴分选（FADS）设备得以开发。

3．微液滴技术用于体外表达系统的酶进化超高通量筛选

基于以上液滴操纵技术的发展，科学家们建立了体外表达系统来表达文库以实现高通量筛选。例如，Fallah-Araghi 等人建立了一个完全体外表达筛选平台，用于从单个基因开始筛选编码酶 β- 半乳糖苷酶的活性基因。在研究中，在液滴融合与分选之前，先将单基因片段与体外表达体系包裹在液滴中。在活性 lacZ 基因与非活性 lacZ mut 基因的比例为 1:100 的模型中，通过一轮筛选实现了对活性基因 502 倍的富集。基于这些例子，Goto 等人报道了一种用于纳升液滴封装和分选的装置，并将该方法用于从变异链球菌（Streptococcus Mutans）中筛选活性更高的异柠檬酸脱氢酶（IDH）。从一个 1000 个变异体的文库开始，在两轮筛选后，他们分离出一种比野生型异柠檬酸脱氢酶活性高约 3 倍的变异体。这些结果充分显示了基于微液滴技术用于酶定向进化的可行性。

图 5. 微流控平台的设计与操作

4．微液滴技术在细胞表达载体中实现基于生化反应的酶进化超高通量筛选

于此同时，使用细胞作为表达载体的方法也被开发与应用于高通量筛选。在Abate、Baret、Griffiths 和 Weitz 等学者的研究中，他们使用芯片式液滴产生和介电泳分选技术 对表面展示了过氧化物酶（HRP）文库的酵母细胞进行了高通量筛选（图 6）。研究中对多达 10⁷个变异体库进行了筛选，并在九轮筛选中实现了总体约 7 倍的催化效率提高。最高的催化效率达到了约 2.5×10⁷ M^-1 s^-1，接近扩散限制效率（即 10⁸ M^-1 s^-1）。类似原理还成功的应用于耐热木聚糖酶的进化（提高活性高达 4.7 倍）和酵母细胞作为生产宿主的改善（ a- 淀粉酶产量增加 2 倍）。

2015 年 Abate 等人展示了首个基于微液滴技术用于大肠杆菌筛选的实例。通过将微流控技术与下一代测序（NGS）相结合，绘制了蛋白质序列-功能关系，分析了分选和未分选的群体。从 6×10⁷个变异体库开始，使用单轮突变，提高了糖苷酶在较高温度的活性。这种深度突变扫描的方法，揭示了糖苷酶活性至关重要的基因区域。

图 6. HRP gene 定向进化实验的示意图

5．微液滴荧光分选技术用于实现催化活性的酶定向进化高通量筛选

如果初始酶的催化活性较低，定向进化与筛选就尤为重要。基于微流控筛选的荧光激活液滴分选（FADS）技术，Hilvert 和其同事利用胺催化作用进化了一种反-醛缩酶（图 6）。使用液滴微流控技术，科学家将表达文库大肠杆菌与荧光底物、细胞裂解液共同包裹在液滴中。对六个文库进行筛选，在单次筛选中鉴定出一种与底物亲和力几乎增加 80 倍的变异体酶。 在依靠中通量筛选（使用 MTP）方法时，这项研究需要进行五轮定向进化来安装这些突变。利用微液滴高通量筛选技术，仅经过两轮进化，就确定出表现最好的突变体，其包括 10 个突变体酶，k_cat/K_M 增加 73 倍和对 (S)- 甲醇的偏好增加了 10 倍 。同一小组还报告了从 10⁷ 个变异库单轮筛选即鉴定出了一种活性环己胺氧化酶（CHAO），重塑了 CHAO 的活性位点，使催化效率提高了 960 倍，接近了非天然底物的野生型活性水平。

图 7. 基于微流控荧光活动筛选技术的反醛酶定向进化

过去 20 年中，液滴微流控技术的进步为发现具有新功能或改进功能的酶迈出了决定性的一步。更高的通量和简化的筛选显著缩短了规模的库定向进化时间并降低了物质消耗。

许多研究小组现在正在致力于改进在工业或医学领域具有重要意义的酶。除了进化自然酶外，定向进化的工具箱还扩展到人工酶，以引入在制药工业中急需的非自然反应性，包括设计全新的酶以了解和重新设计酶的活性位点，最近更是结合机器学习进行定向进化。此外，由于一些荧光底物无法合成，因此快速但非基于荧光检测的新策略对于未来的发展至关重要。

液滴微流控为自动化工作流和更快的筛选铺平了道路。为了继续在这个繁荣的领域前行，必须进一步简化微流控系统，以使非专业人员能够对微流控设备进行可靠的操作。目前，很多高校以及研究所实验室在酶进化方向已经有很多探索，但在工业届的大规模应用仍然受制于成熟仪器、成熟方法学的广泛应用。

达普生物，作为中国液滴微流控领军企业，致力于提供世界领先的生命科学解决方案。其自主开发的基于微液滴法的高通量酶进化解决方案，完美契合了酶进化领域对于成熟仪器及高通量、低成本的需求，是酶进化筛选领域标准化，走向工业化大规模应用的强有力工具。