达普生物发布数字PCR法的超敏新型冠状病毒(COVID-19)定量检测方案

发表时间:2020-03-31 17:56

    新型冠状病毒(COVID-19)自 2019 年 12 月被发现以来迅速在全球蔓延,给全世界人民的生活和健康造成巨大伤害,准确及时的检测是防控新型冠状病毒的关键之一。新型冠状病毒的检测策略通常分为免疫学检测和核酸检测。但在感染初期,病原体抗原含量较低,免疫学检测不易检出。所以核酸检测作为目前检测的主流方法,其中以荧光定量 PCR(RT-qPCR)为主要方案。在一月份,中国疾控和 WHO 就公示了 PCR 检测的引物探针序列,使核酸检测试剂盒得以有效快速的增加,对疫情控制起了非常重要的作用。然而,在临床应用过程中发现,RT-qPCR 方法对于真实病例的检测率约为 30-50%,存在多次检测假阴性的情况,特别是对低感染时可疑样本 (Ct 值在 37-40 之间)的阴性/阳性判定,存在较大争议。造成这一现象的原因:一方面是 qPCR 方法学本身的局限性;另一方面是样品在采集、运输或提取过程中的不合理处置导致的。数字 PCR 技术相比于传统荧光定量 PCR,具有更加出色的灵敏性、特异性和准确性。大量科学研究已经证明,数字 PCR 技术的最低检测限(LOD)会比荧光定量 PCR 低,而且结果重复性更好;同时,能对核酸分子直接进行绝对定量检测,无需标准曲线即能得到准确的样本核酸分子浓度。数字 PCR 技术将对COVID-19 的检测发挥重要的作用,特别是对无症状感染、低感染或潜伏期感染患者的检测,患者在治疗过程中病毒载量变化监测以及病人出院复核等方面,有着突出的潜力。达普生物推出自主研发的星云数字 PCR 系统(Nebula Digital PCR)以及逆转录数字 PCR 一步法试剂(RT-dPCR Universal Mix),并此平台上开发了新型冠状病毒的多重数字 PCR 法检测试剂盒。试剂盒实现在单个反应中针对 orf1ab(open reading frame)、N 蛋白(nucleoprotein)及内控 Rnase 基因区段,进行超敏病毒 RNA 三重定量检测。其中,orf1ab(Cy5 通道)和 N(FAM 通道)基因检测使用中国疾控中心发布的引物探针序列;同时,试剂盒引入美国 CDC COVID-19 检测方案中的 RNase 作为内参,以避免因样品采集、运输和提取不合理而导致的假阴性。

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【实验结果】

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图 2. 新型冠状病毒(COVID-19)多重数字 PCR 定量检测结果。

(1)A 中 FAM 通道 的 1D 散点图阳性点为蓝色(上:N+RNase;中:N;下:RNase),阴性点为黑色;A中 Cy5 通道的 1D 散点图阳性点为红色(上:orf1ab +RNase;中:orf1ab;下:RNase),阴性点为黑色;

(2)2D 散点图(各点簇代表基因:1.orf1ab; 2.RNase; 3.N; 4.orf1ab+RNase; 5.orf1ab+N; 6. N+RNase; 7. orf1ab+N+ RNase)。

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图 3. 浓度稀释测定曲线。orf1ab 和 N 基因样本由 1mL 假病毒样本(10 copies/mL)提取得到,RNase 样本为健康人咽拭子 RNA 提取得到,各组实验中对 orf1ab 和 N 基因进行稀释,而 RNase 样本用量相同。

      本次测试以 orf1ab 和 N 的假病毒 RNA 提取液以及人类咽拭子 RNA 提取液为样本,模拟在临床中的实际情况。图 2 为数字 PCR 检测结果散点图,显示散 点分离效果明显。图 3 为浓度稀释测定曲线,针对 orf1ab 和 N 基因进行稀释,同时保持内参基因 RNase 的加入量不变。通过图 3 可以观察到,在稀释 10²-10⁵倍区间内(即在 1mL 样本量提取 RNA 的情况下,样本病毒浓度在 10²-10⁵copies/mL),orf1ab 和 N 基因测得浓度结果线性关系显著;同时对于内参基因测得浓度,多次测定结果的 CV 为 4.8%,无显著差异。因此,本检测的新冠病毒检测限为 10² copies/mL,线性检测范围为 10²-10⁵copies/mL。而同类 RT- qPCR 试剂盒,检测限一般为 10³ copies /mL,而且无定量检测能力,同时一般也缺乏内参进行控制。

检测结果展示了新型冠状病毒(COVID-19)多重数字 PCR 法检测试剂盒优秀的性能。1. 超敏的检测能力:更低的检测限可以更早检出病人,也可减少因病毒量过少而误判的阴性;2. 杰出的定量能力:无需借助标准曲线即可直接测得病毒浓度,对病程判断有重要作用;3. 准确的检测结果:一次检测多个基因,同时还引入内参,以发现因为样本处理原因而导致的假阴性结果。

      达普生物目前正在与医院推进临床案例研究,希望在多重数字 PCR 检测上建立一套可靠的检测方案,整合全自动化核酸提取设备、病毒核酸快速提取试剂、数字 PCR 仪、微流控芯片及检测试剂等,推出一整套解决方案。务求降低假阴性风险,提高检测的准确性,为传染性疾病的检测提供更加灵敏、准确的检测方法,为临床提供更多选择。


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