单细胞转录组测序分析揭示EGFR突变肺腺瘤中抑制性免疫肿瘤微环境

肿瘤微环境是肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质（ECM）。肿瘤微环境对肿瘤的免疫抑制，耐药，肿瘤侵袭，转移生长等发挥着至关重要的作用。

图 1. 肿瘤微环境特征

单细胞转录组测序是深入探索 EGFR 突变肺腺瘤中抑制性免疫肿瘤微环境的利器。

关键发现

“肿瘤”是一个复杂的生态系统，以往研究表明，EGFR 突变型肺腺癌（EGFR-LUAD）的肿瘤突变负荷（TMB）较低，免疫治疗疗效不佳，且 EGFR-LUAD 的免疫微环境（TME）尚不清楚，这都为该疾病的治疗增加了难度。到目前为止，肿瘤微环境（TME）在 EGFR 突变患者免疫治疗中的研究还不全面。

据此，杨蕾博士和其团队发表了一篇题目为 “Single-cell transcriptome analysis revealed a suppressive tumor immune microenvironment in EGFR mutant lung adenocarcinoma” 的文章。该文章运用单细胞转录组测序（scRNA-seq）的分析方法，从细胞组成和功能的角度，揭示了 EGFR 突变型肺腺癌（LUAD）的特异性肿瘤微环境（TME），其研究成果发表于《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》杂志上（IF=13.751），为 EGFR 突变 LUAD 患者的治疗提供了理论基础和新思路。

实验设计

1、样本信息：

8 名患者的 9 份 LUAD 肿瘤组织，5 份 EGFR 突变型，4 份 EGFR 野生型样本。

2、实验流程：

图 2. 样本信息、实验设计流程示意图

实验内容

对获得的 9067 个上皮细胞分析，基于拷贝数变异信息将其分为肿瘤细胞和正常细胞，并最终得到 13 个细胞亚群（ 10 个肿瘤细胞亚群，3 个正常细胞亚群）。根据差异丰度测序分析，EGFR 阳性组细胞亚群 1 和 5 特异富集 ，EGFR 阴性组细胞亚群 0、6、8 和 11特异富集 。

推测：EGFR 阴性肿瘤细胞可能比突变的肿瘤细胞更能促进 CD8+ T 细胞的增殖和功能。

图 3. 在 LUAD 中具有不同 EGFR 突变状态的上皮细胞

提取 T 细胞进行细分，发 现CD8+ 组织细胞在 EGFR 阴性组中较高，CD103 是 TRM 细胞表面表达的标志物，且 CD103+CD8+ TRM 细胞与多种癌症免疫治疗后生存率的提高有关，后续的 mIHC 结果也显示 EGFR 阴性组 CD103+CD8+ T 细胞比例更高。

图 4. LUAD 中的 T 细胞和 NK 细胞簇

对 T 细胞分泌细胞因子研究，发现 CD8+ TRM 中 CXCL13 的表达更高。CXCL13 可介导肿瘤对 B 细胞的招募，并对三级淋巴结构（TLS）的形成至关重要，TLS 是癌症对免疫治疗反应的积极预测因素。mIHC 结果也显示 EGFR 阳性组的 T 细胞表达更多的免疫抑制细胞因子。总体，单细胞测序结果显示：EGFR 阳性 LUAD 的 T 细胞中 CD8+ TRM 细胞缺失，CXCL13 表达降低，免疫抑制因子表达却升高，这提示 EGFR 突变对 TME 有负向修饰作用。

B 细胞是 TLS 最重要和最基本的组成部分。细胞与细胞相互作用分析显示，表达 CCR7 的 B   细胞可与表达 CCL21 的肿瘤巨噬细胞互作，而 CCR7 在 EGFR 阴性组的B细胞中表达较高，综合之前一些报导的数据，总体表明来自 EGFR 阴性组的B细胞可能已被肿瘤巨噬细胞招募，并具有在肿瘤微环境中构建 TLS 的潜力。

图 5. B 细胞聚类和差异基因表达

对   LUAD-TM 中的细胞相互作用分析，发现两个特异性细胞亚群之间的配体-受体结合对在 EGFR 阴性组和阳性组中存在差异：有些配对在两组中均存在，而有些仅在 EGFR 阴性组或阳性组中出现。结果可能为 EGFR 突变 LUAD 的免疫治疗提供新的思路。

图 6. EGFR 突变状态决定宏观表达差异

总结

本研究从单细胞层面上阐释了 EGFR 突变型和野生型 LUADs 肿瘤微环境的细胞组成和相互作用的异质性，EGFR 突变型 LUAD 与 EGFR 野生型 LUAD 具有截然不同的特异性 TME。肿瘤细胞的 EGFR 基因可能通过直接或间接改变 TME 周围不同类型细胞之间的通讯，从而在 TME 构建中起决定性作用。

作者将公开发表的免疫治疗后样本的 scRNA-seq 数据与自己未经治疗样本的数据进行了比较，并且进行了 mIHC 以加强研究结果的可信度，以此揭示未来 EGFR 突变型 LUAD 免疫治疗的一些潜在方向。未来可考虑对 EGFR 突变型 LUAD 进行联合免疫治疗，以改善抑制性肿瘤免疫微环境。

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